通过精制层析纯化AAV载体
本文节选自“Moving from the Bench Towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno-Associated Viral Vector Purification”，更多详细内容，请参考原文或往期文章《AAV细胞培养液的收获的澄清》。
典型AAV下游工艺示意图。
精制层析的目的是减少亲和层析步骤后仍存在的杂质。对于许多生物工艺，这些步骤被设计用来去除工艺相关的杂质，如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、脱落的亲和配基，以及产物相关的杂质，如产物的聚体或裁剪的异构体。
精制层析可以采用多种不同的方式进行，传统的填充床层析、膜吸附和整体柱是最主要的方式。对于AAV而言，膜吸附和对流作用介质(CIM)整体柱可能比传统的、基于基球的层析更有吸引力，因为这些较大的生物分子能够轻易地与所有结合位点相互作用。填充床层析可能受到孔隙度和AAV扩散速率的限制，而膜允许在更高的流速下进行处理，因其主要通过基于对流的传质，而没有填充床层析基球所表现出的扩散限制。CIM整体柱同样通过利用甲基丙烯酸酯整体柱的优势，可形成大的流动通道，从而形成对流质量输送，并达到动态结合或分离能力，从而获得与膜类似的优势。
实际工艺中，有一种杂质很难去除，或者至少在AAV生产工艺中，很难控制针对它的工艺一致性，那就是空的或部分的衣壳，也就是衣壳没有包封含有目的基因的所需DNA。它们与完整衣壳一起产生，空衣壳与完整衣壳的比例从3:1到30:1不等。分离空AAV衣壳的必要性一直是一个热门话题，目前仍正讨论中。在许多临床试验中，生产商会执行一个专门的步骤，来减少空衣壳的数量，而且无论如何，批次间和所报告的比例应该是一致的。
多项研究表明，AEX可以分离多种AAV血清型的空/完整衣壳。在pH值为8.5和9.0的情况下，POROS™HQ和Q Sepharose®XL使用乙酸铵(NH4Ac)缓冲体系，分离空的和完整的AAV2载体，AAV2载体收率为74%，最终产物中的空载体小于20%。这表示空衣壳减少了86倍。在使用四甲基硫酸铵([(CH3)4N]2SO4)梯度洗脱纯化AAV1的工艺中，POROS™HQ也能够获得空颗粒小于5%的产品池，收率为40-50%。此外，离子交换膜吸附的使用，如Mustang S和Mustang Q膜以及阴离子交换整体柱CIMmultus™QA 也已被证明是纯化完整AAV8衣壳的方法，且不需要结合使用密度梯度离心。对于结合和洗脱(正模式)阴离子交换层析，高pH缓冲液对于获得更高的载体收率很重要，pH 7.5和9.0 (20mM Bis Tris)分别可以获得24%和43%的AAV8回收率。最后，需要指出的是，AAV血清型与阴离子交换填料的结合特性不同，AAV5需要更强的酸性条件才能有效地与阴离子交换填料结合，而AAV8则需要更为偏碱性的条件才能达到最佳结合。这种结合方式上的差异表明，为了确保最佳收率和分离效率，可能需要针对不同血清型设计专门的方案，而不是平台化的方法。
有多种正交技术可用于对AAV样品的空衣壳和完整衣壳进行定量。分析型超速离心法(AUC)被越来越多地认为是一种“金标准”方法，其可根据浮力密度差异区别空、完整和部分荷载的AAV载体。透射电子显微镜(TEM)被广泛用于对负染后的空衣壳和完整衣壳进行视觉区分和进一步的定量。由于空衣壳会降低吸光度A260/A280比率，所以在260nm和280nm处的UV吸光度也可显示空衣壳和完整衣壳的量。电荷检测质谱(CDMS)可用于测量质量电荷比和单个离子电荷。分析型阴离子交换色谱也可以使用，其利用与生产规模中空颗粒和完整颗粒分离时相同的分离原理。此外，还可以使用ELISA和数字液滴PCR来分别评估衣壳和基因组数量，以及估计空衣壳和完整衣壳的比例。
如之前文章所述，需要再次注意的是，如果层析装置重复使用，则需要记录有效清洗、再生、消毒以及针对性能一致性的研究，且如果某一步骤被声称为除病毒步骤，还需包括其在生命周期内的除病毒性能的研究。下表所示为报导的AAV纯化中，用于空和完整衣壳精制层析的所有填料形式。
原文：B.Adams, H.Bak, A.D.Tustian, Moving from the Bench Towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno-Associated Viral Vector Purification. 2020, Biotechnology & Bioengineering, https://doi.org/10.1002/bit.27472.
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